Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统用于提高基因编辑效率
Alt-R CRISPR-Cas9系统包括成功进行基因组编辑所需的所有试剂。基于天然S. pyogenes CRISPR-Cas9系统，Alt-R CRISPER-Cas9系统与其他方法相比拥有更多的优势：
靶向编辑效率更高
通过运送RNP提高精度控制
节省时间
减少费用
使用Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS进行高效编辑
Alt-R CRISPR-Cas9系统包括高效的Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS。通过将Alt-R S.p.Cas9 Nuclease 3NLS与优化的化学修饰Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA和tracrRNA结合形成一个RNP，该系统优于其他编辑方法（图1）。RNP转染允许对编辑复合体进行最佳剂量控制，并且不可再生的Cas9RNP可以在短时间内通过内源性机制被清除，有效地限制了脱靶编辑。
图1 优化的crRNA：tracrRNA优于其他guide RNA类型。
Alt-R™ CRISPR-Cas9 RNA、天然的S. pyogenes CRISPR RNA、体外转录（IVT）single-guide RNA（sgRNA）和通过表达质粒或gBlocks® 基因片段表达的sgRNA均靶向4个人类HPRT基因位点（38087 AS、38509 S、38285 AS和38636 AS）。将guide RNA转染到稳定表达Cas9的HEK-293-Cas9细胞中。使用T7EI测定法的突变检测显示，Alt-R CRISPR-Cas9RNA在大多数位点的表现优于其他guide RNA类型。
高效的性能可简化设计
Alt-R CRISPR-Cas9系统中优化的crRNA 和tracrRNA 优于其他CRISPR guide RNA形式（图2）。实际上,该系统非常高效,因此cr RNA需要最少的设计工作。唯一需要提供的是一个与您靶基因中的PAM（前间区序列邻近基序；NGG）序列紧邻的、具有位点特异性的19或20个碱基的序列。使用Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA,在标准条件下,平均>80%的靶序列将显示有效的编辑。
图2 针对STAT3基因中92个PAM位点设计的Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA提供了高效的编辑效率。
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA（n=92），靶向STAT3基因座中的每个PAM位点。使用T7EI测定法的突变检测显示，93%的crRNA在HEK-293-Cas9细胞中表现出了良好至优异的性能，编辑效率>20%。注：T7EI不能检测单碱基缺失或插入，会使编辑效率被低估。
Alt-R S.p.HiFi Cas9 Nuclsase V3-高度特异性的
基因编辑即使在极具挑战的条件下也可以实现
基因编辑即使在极具挑战的条件下也可以实现
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3是一种高保真型S.pyogenes Cas9 蛋白，可显著降低脱靶效应而不影响性能，是常规实验的首选，也是具有挑战性的基因组编辑应用的理想之选
优势
通过极大降低脱靶活性来实现特异性增加与市场领先的Alt-R S.p.Cas9 Nuclease V3具有相似的高编辑效率
通过脂质体转染、电穿孔或显微注射，高效运送核糖核蛋白
可以避免通常在体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA中观察到毒性或先天性免疫反应活性
Alt-R S.p. HiFi Cas9酶在现有应用中可轻松替代野生型Cas9，而无需更改方案。该酶与Alt-R CRISPR-Cas9系统的其他组件兼容，通过同样优越的基于核糖核蛋白（RNP）的工作流程实现精确的基因组编辑。
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3的靶向编辑效率与野生型相近，并可显著减少脱靶位点编辑。
分别将Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3或Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3与靶向EMX1基因的Alt-R crRNA：tracrRNA结合形成RNP复合体。通过Nucleofection™核转染方法（Lonza）将RNP复合体（4 µM）转染至HEK-293细胞。采用二代测序（rhAmpSeq扩增子测序，IDT）检测在靶向基因座和9个已知脱靶位点上的插入/缺失率（在y轴上以对数尺度表示）。
订购信息
CRISPR guide RNA
| 产品 | 规格 | 目录号 |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | 2、10 nmol管装 或平板装 |
订购请咨询 |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | 5 nmol | 1072532 |
| 20 nmol | 1072533 | |
| 100 nmol | 107253 |
HiFi Cas9 Nuclease
| 产品 | 规格 | 目录号 |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | 100 µg | 1081060 |
| 500 µg | 1081061 |
对照试剂盒*
| 产品 | 目录号 |
| Alt-R CRISPR-Cas9人类对照试剂盒（2 nmol） | 1072554 |
| Alt-R CRISPR-Cas9小鼠对照试剂盒（2 nmol） | 1072555 |
| Alt-R CRISPR-Cas9大鼠对照试剂盒（2 nmol） | 1072556 |
* 对照试剂盒组件也可单独提供。
对照试剂盒组件
- • Alt-R CRISPR HPRT阳性对照 crRNA
- • Alt-R HPRT PCR Primer Mix
- • Alt-R CRISPR阴性对照 crRNA #1
- • Nuclease-Free Duplexing Buffer
- • Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA
Alt-R S.p.Cas9核酸酶与其变体的比较
| Alt-R S.p.Cas9 核酸酶 |
Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 |
Alt-R S.p. Cas9 D10A 切口酶 |
Alt-R S.p.Cas 9 H840A切口酶 |
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| 描述 | 野生型Cas9酶，具有较高的基因组编辑能力，易于使用且经济实惠 | 突变的Cas9酶，在减少脱靶效应的基础上增加特异性，同时保持较高的靶向活性 | 突变的Cas9酶，在RuvC结构域中发生突变，使其缺失在非靶向链的切割能力 | 突变的Cas9酶，在HNH结构域中发生突变，使其缺失在靶向链的切割能力 |
|---|---|---|---|---|
| DNA切割 | 双链 | 双链 | 靶向链 | 非靶向链 |
| 建议用途 | 大多数CRISPR基因组编辑项目的首选 | 对于对脱靶事件敏感且需要高水平编辑效率的实验是理想之选 | 适用于同源定向修复（HDR）实验，但需要两个合适的切割位点位于彼此最佳距离内 | |
| 分子量 | 162,200 g/mol | |||
| 规格 | 100 µg或500 µg | |||
| 浓度 | 10 mg/mL（62 µM）于50%甘油中 | |||
| 运输条件 | 干冰 | |||
| 储存条件 | 在储备液中-20°C储存 | |||
| 稀释 | 使用前用Opti-MEM®培养基（Thermo Fisher）或PBS稀释 | |||
Cas9系统 VS Cas12a系统（Cpf1)
| Cas9 system | Cas12a system | |
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| 应用 | 一般的基因组编辑 | ●对于具有富含AT的基因组的物种 ●对于使用CRISPR-Cas9系统设计空间有限制的区域 |
|---|---|---|
| 核糖核蛋白组件 | ●gRNA选择： ●Cas9内切酶 |
●crRNA ●Cas12a内切酶 |
| Alt-R CRISPR酶 | ●野生型 ●HiFi ●切口酶（D10A和H840A） |
●野生型 ●Ultra（性能更佳） |
| Cas9 crRNA： tracrRNA（选择1） |
●crRNA ●天然：42 nt ●Alt-R：35–36 nt（推荐使用36 nt） ●天然：89 nt ●Alt-R：67 nt |
— |
| Cas9 sgRNA（选择2） | ●Alt-R：99-100 nt（推荐使用100 nt） |
— |
| Cas12a crRNA | — | ●天然：42–44 nt ●Alt-R：40-44 nt（推荐使用41 nt） |
| CRISPR酶 | ●Class 2，Cas type II ●M.W.*：162,200 g/mol ●内切酶结构域：RuvC-like和HNH |
●Class 2，Cas type V ●M.W.*：156,400 g/mol ●内切酶结构域：仅RuvC-like |
| 双链DNA切割 | ●野生型和HiFi：切割位点在前间区序列上游3个碱基的位置，形成平末端 ●D10A切口酶和配对crRNA：5’突出端 ●H840A切口酶和配对crRNA：3’突出端 ●PAM位点在基因组编辑过程中经常被破坏 |
●切割位点在前间区序列的5’端，形成5’突出端 ●PAM位点在基因组编辑后可能会继续存在 |
| PAM序列† | NGG | ●对于Cas12a V3，TTTV ●对于Cas12a Ultra，TTTN |
| 建议运送Alt-R RNP的方法 |
●使用/不使用Alt-R enhancer, 通过电穿孔运送 ●显微注射 ●脂质体转染 |
●使用Alt-R enhancer,通过电穿孔运送 ●显微注射 |
* Alt-R核酸酶的分子量
† N = 任意碱基；V = A、C、或G
† N = 任意碱基；V = A、C、或G
Alt-R HDR设计工具及模板
借助智能易用的设计工具，提高CRISPR-Cas9介导的同源重组修复（HDR）的效率
Alt-R HDR Donor Oligos是可直接用于HDR的质量最高的寡核苷酸，长度可达200个碱基。其中包括2个硫代磷酸酯（PS）键和在序列两端IDT专有的封端修饰，以提供更高的稳定性（图1A）。
IDT提供3种格式的供体ssDNA链：未修饰、PS修饰和Alt-R HDR修饰。我们的数据表明，使用Alt-R HDR修饰可得到最高的HDR效率（图1B）
我们对几种化合物提高HDR效率的能力进行了测试。结果是，我们的Alt-R HDR Enhancer大大优于所有其他化合物，能够提升HDR效率三倍以上（图2）。
我们对Alt-R HDR Enhancer与Alt-R修饰的HDR供体寡核苷酸结合能否进一步提高HDR速率进行了研究。我们的数据证实了这种方法很有效，能够得到最高的HDR比率（图3）
（图1）
（图2）
（图3）
使用文献
1. Vakulskas CA, Dever DP, et al. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant deliverd as a ribonucleoproteincomlex enables efficient gene editing in human hematopoietic sten and progenitor cells. Nat Med. 24:1216–1224. doi: 10.1038/s41591-018-0137-0.
2. Park SH, Lee CM, et al. (2018)rived Highly effocent editing of the beta-globin gene in patient de hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Blood, 132(Suppl 1),2192. doi: 10.1182/blood-2018-99-117371.
关于IDT
公司简介
美国Integrated DNA Technologies公司（以下简称IDT）创办于1987年，是寡核苷酸合成领域的领导者，在过去的30多年里IDT致力于为学术研究、农业发展、医疗诊断、药物研发等领域开发和制造核酸产品，IDT可以为客户提供高品质的产品、专业的技术支持和个性化的定制服务。在分子生物学领域，IDT为二代测序、基因编辑、qPCR和RNA干扰等领域开发了一系列专有技术。IDT生产的GMP级别产品被广泛应用于多种癌症以及遗传和感染性疾病的诊断试剂研发，并通过不断优化自动化合成平台的处理技术来加快原研试剂的开发和生产。
IDT为100多个国家和地区的超过120,000名生命科学研究人员提供服务，每天生产70,000多条核酸产品。IDT针对基因组学应用开发的创新工具和解决方案正在打破研究壁垒，激发您的梦想，实现下一个突破。
