技术特点
AMSPHERE A3产品概述
描述
| 产品名称 | Amsphere™ A3 |
|---|---|
| 基质 | 甲基丙烯酸聚合物 |
| 平均粒径 | 50µm |
| 配基 | 在大肠杆菌中表现的重组蛋白 |
| 载量（DBC） | 约54mg/mL多克隆抗体 |
| 最大运行压力 | 0.8MPa** |
| 最大运行速度 | 1200cm/h（取决于层析柱的尺寸） |
| 建议的柱床高度 | 5-25cm |
| 运行的pH范围 | 1-13 |
| CIP稳定性 | 0.1-0.5M NaOH |
| 推荐的保存溶液 | 50mM磷酸钠缓冲液，含16%乙醇，pH7.5。 |
Amsphere™A3构造
Amsphere A3是一种新型Protein A树脂，其采用了表面改性的珠状基底物和耐碱型配体优化设计。
蛋白A配基
•通过控制构象和取向保持高DBC
•通过蛋白质工程提高了碱稳定性
表面改性
•通过表面亲水性改性降低HCP水平
基质
•高流速下可以保持高DBC
•通过刚性交联获得优异的压力和流动性
*在柱长为20cm的层析柱中，在300cm/hr的线速度下，10%穿透的DBC。
**不要超过层析柱的耐压能力。
**不要超过层析柱的耐压能力。
使用方法
运行条件
通用条件：
>请确保所有缓冲液和样品原料均经过0.22µm滤膜过滤后使用。
>为了平衡层析柱，最好选用中性缓冲液或具有与原料相似组成的缓冲液。例如，可以使用20mM磷酸钠，pH7.5或25mM Tris-HCl，pH7.0和0-150mM氯化钠。
层析柱的装柱和评估
>Amsphere A3的装柱详见我们的“Amsphere A3层析柱的装柱方案”，此方案可从JSR Life Sciences网站获得。
>建议在首次使用该层析柱之前执行以下空白运行。
>该层析柱经平衡后即可使用。
洗脱缓冲液
100mM乙酸钠，pH3.2或首选的洗脱缓冲液，包括甘氨酸、柠檬酸盐等。使用3-5 CV。
CIP缓冲液（可选）
0.1M NaOH。在室温或更低温度下采用30分钟的接触时间。
平衡缓冲液
20mM磷酸钠，pH7.5。使用3-5 CV。
样品上样
树脂的容量取决于抗体种类、盐浓度、pH和抗体载量流速。因此，在放大工艺规模前，建议小规模优化加载条件，通过测量色谱参数，如DBC等。
清洗
清洗缓冲液的性能，如体积、电导率和pH，可根据抗体载量和最终用户的首选缓冲液进行修改。如果需要大量去除宿主细胞蛋白质（HCP）或脱氧核糖核酸（DNA），建议按照以下顺序使用缓冲液：
1.20mM磷酸钠，pH7.5，1-2 CV
2.20mM磷酸钠，500mM-1M氯化钠，pH7.5，4-6 CV
3.20mM磷酸钠，pH7.5，2-2 CV
有时清洗缓冲液可以在较低pH的缓冲液中加高盐，其次是无盐缓冲液：
4.100mM醋酸钠，pH6.0，2 CV
5.100mM醋酸钠，500mM-1M氯化钠，pH6.0，4 CV
6.100mM醋酸钠，pH6.0，4 CV
注：Amsphere A3建议采用盐洗（500mM-1M盐）
洗脱
一般的酸性缓冲液可用于洗脱。建议使用醋酸钠缓冲液，但也可以使用柠檬酸钠或甘氨酸。为了确定洗脱的最佳pH，可以在小范围内进行线性梯度洗脱。收集馏分并用1.0M Tris-HCl进行中和，并测定单克隆抗体产品的馏分。可以确定适用于峰单克隆抗体洗脱的最佳pH条件。
再生
抗体洗脱后，可使用比洗脱缓冲液酸性更高的5 CV缓冲液冲洗层析柱上的残留物。最好优先使用乙酸、盐酸或磷酸溶液（pH1.5-3.0、20-200mM）
层析运行示例
图1显示了在从CHO获取的细胞培养物中使用Amsphere A3以纯化单克隆抗体的示例。使用柱高为5cm、内径为0.5cm（1mL）的层析柱。在4分钟保留时间内，单克隆抗体的DBC为44mg，并且高纯度抗体的回收率为94%。
图1：使用Amsphere A3从CHO细胞收获液中提纯单克隆抗体
CIP
CIP的标准条件如下：0.1M-0.5M NaOH。
推荐的CIP方案如下：
1.用至少2 CV的0.1M NaOH清洗层析柱。15-30分钟的接触时间就足够了，并且具体时间将取决于纯化的抗体原料。
2.用大约5 CV的平衡缓冲液清洗层析柱，或直至pH稳定。
注意：
• 当将溶液泵入层析柱时，不要使用高流速，因为高流速可能会增加压强。
• 尽管Amsphere A3具有耐碱性，但与碱性缓冲液的长时间接触会降低其DBC。CIP后立即用平衡缓冲液平衡层析柱。碱性稳定性数据可从JSR Life Sciences获得。
存储
在含有16％乙醇的磷酸钠缓冲液中存储A3介质。应将层析介质储存在2-8℃之间，不应对其进行冷冻。储存装有Amsphere A3的层析柱时，请用含有16-20％乙醇的缓冲液平衡层析柱，并将其存储在2-8℃的温度之间。或者，也可以使用2%的苯甲醇。长期存放后，建议在使用前做一次空白运行（包括CIP在内）。